• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1988006621A1
    申请号:PCT/JP1988/000205
    申请日:1988-02-26
    公开日:1988-09-07
    发明作者:Yosuke Aoki；Kiyoshi Okano；Masanobu Naruto；Hirohiko Shimizu；Haruji Nakamura
    申请人:Toray Industries, Inc.；
    IPC主号:C12N9-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] セリ ンプロテア一ゼおよびセリ ンプロテアーゼ遺伝子 技 術 分 野
    [0003] 本発明は炎症の発現に関与し、 さ らにリ ンパ球、 単球、 N K細胞および顆粒球の機能を変化させる働きを有する セリ ンプロテア一ゼ、 その前駆体、 およびそれらをコー ドする遺伝子に関する。
    [0004] さ らに、 本発明は、 細胞特異的な遺伝子発現に必要な 転写制御領域の D N A配列に関する。
    [0005] 背 景 技 術
    [0006] 青木洋祐らは、 骨髄細胞のうち赤芽球と顆粒球に新規 なセリ ンプロテア一ゼを見い出し、 これをメ ダラ シ ン (niedul lasin) と命名し、 メダラ シ ンに N K細胞活性化 作用および起炎作用のあることを明らかにした（J.Biol . Cheui. 253. 2026-2032 (1978) ； J.Clin. Invest. 69, 1 223-1230 (1982) ) 。
    [0007] そ して同じく青木洋祐らによってメダラ シンの有する 下記のような生物活性が明らかにされ、 報告されている。
    [0008] ① 赤芽球において、 ヘム合成の調節に関与しピリ ドキ シン反応性貧血の発現.に関与する。
    [0009] ② 慢性炎症に随伴する貧血の発現に関与する。
    [0010] ③ 顆粒球のメダラ シン活性は慢性炎症性疾患増悪期に 増大する。
    [0011] ④ 生理的濃度のメ ダラ シ ンを動物皮内に注射すると単 球浸潤を特徵と した炎症が惹起され、 細静脈内皮細胞 が特徵的に変性する。
    [0012] ⑤ ヒ ト リ ンパ球をメ ダラシン処理すると、 その D N A - および R N A合成能が増大し、 各種マイ トージヱンに 対する反応性が著増する。
    [0013] ⑥ 単球をメダラシン処理すると、 その遊走能が阻止さ れてスーパ一ォキサイ ド産生能が増大する。
    [0014] ⑦ 顆粒球をメダラシン処理すると遊走能が増大する。
    [0015] ⑧ ヒ ト リ ンパ球をメダラシン処理すると、 その N K活 性が著増し、 これはイ ンタ一フエロン産生を介さない。 メダラ シンの全ァ ミ ノ酸配列は未だ解明されておらず、 メ ダラ シンの取得にはヒ ト骨髄細胞も しく は顆粒球が供 耠源として用いられている。 従って、 その供耠量には限 りがある。
    [0016] 本発明は、 遺伝子組換え法によつてメ ダラ シンに対応 する遺伝子をク ロー ン化して、 その配列を明らかにする ことを第一の目的とする。 これによつて、 メ ダラシンも しく はその前駆体をコー ドする遺伝子を明らかにするこ とができると同時に、 それによつてメ ダラ シンのァ ミ ノ 酸配列を解明することができる。 第二に、 本発明はメダ ラシンの化学合成法も しく は遺伝子組換え法による合成 を可能なら しめ、 純度の高いメダラシンを大量に得るこ とを目的とする。
    [0017] メダラシンは、 ヒ ト骨髄細胞中あるいは末梢血細胞中 においてかなり多く含まれている。 例えば、 ヒ ト末梢血 1 mlの中に約 1 ◦ ^ gのメ ダラ シンが確認されている。 しかしながら他の組織や細胞中には殆んど見い出されて おらず、 ヒ ト血球系細胞、 特に白血球や赤芽球等にのみ 特異的に発現されている。
    [0018] 従って、 メ ダラ シン遺伝子の発現機構を明らかにする ことは、 これまでに明ら力、になっていないヒ トの白血球 あるいは赤芽球系に特異的な遺伝子発現を解明する もの と期待される。
    [0019] 一般に細胞特異的な遺伝子の発現は、 その細胞に特異 的なタ ンパク質をはじめとする因子類 （ トラ ンス因子） とと もに、 当該染色体遺伝子の周辺および内部に存在す る遺伝子配列によって制御されている。 従って、 前述の ヒ ト骨髄細胞由来セリ ンプロテアーゼ、 メ ダラ シ ンの染 色体遺伝子の周辺も し く は内部には、 ヒ ト血球細胞のう ち白血球や赤芽球特異的な遺伝子発現に必要な転写制御 領域の D N A配列が存在することが考えられる。
    [0020] 従って、 本発明は第三に、 細胞特異的な遺伝子発現に 必要な転写制御領域の D N A配列を提供すること も目的 とする。
    [0021] 発 明 の 開 示
    [0022] 本発明は、 第 1図に示されるア ミ ノ酸配列を有するポ リベプチ ドが呈する生物活性を示すセ リ ンプロテア一ゼ、 およびそれをコ一 ドするセ リ ンプロテア一ゼ遺伝子であ る 0
    [0023] また、 本発明は、 第 1図に示すア ミ ノ酸配列の全部ま たは一部を有するポ リべプチ ドが呈する生物活性を示す セ リ ンプロテア一ゼの N—末端に、 開裂可能なぺプチ ド またはシグナルぺプチ ドが結合してなるセリ シプロテア ーゼ前駆体、 およびそれをコー ドするセリ ンプロテア一 ゼ前駆体遺伝子である。
    [0024] さ らに本発明はヒ ト骨髄細胞のセリ ンプロテア一ゼの 染色体遺伝子に含まれる転写制御領域をコー ドする D N A配列である。
    [0025] 図面の簡単な説明
    [0026] 第 1図、 笫 3図および第 5図は本発明のセリ ンプロテ ァ一ゼの全部または一部のァ ミ ノ酸配列であり、 第 2図 および第 4図は本発明のセリ ンプロテアーゼ遺伝子を含 む D N A塩基配列の一例を示す。
    [0027] 第 6図は本発明のセリ ンプロテアーゼ前駆体のァ ミ ノ 酸配列の一例であり、 第 7図は本発明のセリ ンプロテア —ゼ前駆体遺伝子を含む D N A配列の一例を示す。
    [0028] 第 8図〜第 1 4図は本発明のセリ ンプロテア一ゼを発 現するためのべクターの作製方法を示す。
    [0029] 第 1 5図は、 本発明のヒ ト骨髄細胞も しく は顆粒球由 来のセリ ンプロテア一ゼの染色体遺伝子に含まれる転写 制御領域をコ一 ドする D N A配列の一例であり、 第 1 6 図は本発明のセリ ンプロテア一ゼ構造遺伝子およびその 発現制御領域を含む染色体遺伝子配列を示す。
    [0030] 発明を実施するための最良の形態 本発明のセ リ ンプロテア一ゼは、 第 1図に示される 2 3 8個のァミ ノ酸配列から成るポリべプチ ドであるが、 それと実質的に同等の生物活性が保持されているならば、 上記ァ ミ ノ酸配列に部分的な置換 ·欠失 · 挿入などがな されて構成されるポ リべプチ ドも本発明のセリ ンプロテ ァーゼに含まれる。
    [0031] 一般にプロテアーゼは、 その遺伝子からメ ッセンジャ
    [0032] — R N Aを経由して合成された前駆体タ ンパク質がプロ セッ シングを受けることによって N末端の一部を失い、 さ らにまた、 ある場合には C末端の一部を失う ことによ つて成熟プロテア一ゼになることが知られている。
    [0033] 本発明のセリ ンプロテア一ゼには、 第 1図に示したァ ミ ノ酸配列から成るポ リペプチ ドの、 例えば C末端 1 9 個のァ ミ ノ酸配列がプロセッ シングを受けて除去された 形態のものも含まれる。
    [0034] 本発明のセリ ンプロテアーゼ遺伝子は、 上記の本発明 にい う セ リ ンプロテア一ゼをコ一 ドする遺伝子であって、 第 2図に示す D N A塩基配列を含むものがその代表例で める 0
    [0035] また本発明のセリ ンプロテアーゼ前駆体は、 上記のセ リ ンプロテア一ゼの N —末端に、 開裂可能なぺプチ ドま たはシグナルペプチ ドが結合している ものであり、 第 6 図にその一例を示す。 第 6図のセリ ンプロテアーゼ前駆 体は、 2 6 7個のァ ミ ノ酸配列から成るポ リぺプチ ドで あり、 第 1図のセリ ンプロテア一ゼの上流にシグナルぺ プチ ドを含む 2 9個のァ ミ ノ酸が結合 たものである。
    [0036] 本発明のセ リ ンプロテア一ゼ前駆体遺伝子は、 セ リ ン プロテア—ゼ前駆体をコー ドする遺伝子であって、 第 7 図に示す D N A塩基配列を含むものがその代表例である。
    [0037] 本発明のセリ ンプロテアーゼおよびその前駆体は、 本 発明によってその全ァ ミ ノ酸配列が明らかになつたので、 公知の化学合成法によって製造することもできるが、 遺 伝子組換え法によつて容易にかつ大量に製造することが できる。
    [0038] 遺伝子組換え法によって本発明のセリ ンプロテアーゼ またはその前駆体を製造するには、 まずセリ ンプロテア ーゼまたはその前駆体の遺伝子を含む c D NAを取得す る必要がある。 c D NAは次の工程に従って好ま しく取 得される。
    [0039] ① セリ ンプロテア一ゼ産生細胞からポリ （A) + RN Aを抽出する。
    [0040] ② 抽出したポリ （A) + R N Aを铸型と して逆転写酵 素を用い、 c D N Aを調製し、 種々の c D N Aを含む c D N Aライブラ リ一を得る。
    [0041] ③ 目的の 。 D N Aとハイブリダィズする D N Aプロ一 ブを化学合成し、 これを用いて c D N Aライブラ リー から目的の c D N Aを拾い出す。
    [0042] ここで①の工程におけるセリ ンプロテア一ゼ産生細胞 としては、 ヒ ト急性前骨髄球性白血病 （APL ： Acute Pr omyelocytic Leukemia) 細胞である M L 3 [E.Henderso n および F.Gunz編 " Leukemia" 、 P 119—139 、 Grune & Strakton. New York (1982) を参照〕 が継続的にセリ ンプロテア一ゼを産生するので好ま し く用いられる。
    [0043] ③の工程で用いる D N Aプローブは、 セリ ンプロテア ーゼの N末端側部分のァ ミ ノ酸配列をェ ドマン分解法に より決定し、 それに対応する遺伝子断片である D N Aォ リ ゴマーを化学合成し標識化することによって得られる。 セ リ ンプロテアーゼ遺伝子を含むベクターは適正な発 現べクタ一に組み込まれ、 組換え D N Aが得られる。 こ れを大腸菌、 枯草菌、 酵母あるいは培養動物細胞などの 宿主に導入し、 得られる形質転換体を培養するこ とによ つて目的のセ リ ンプロテア一ゼを産生させる ことができ る。 こ こで宿主と して動物細胞などの真核細胞を用いる と、 糖鎖を伴なつたセ リ ンプロテアーゼが得られる。
    [0044] 以上の遺伝子操作は、 公知の方法 （T.Maniatisら、 "Molecular Cloning A Laboratory Mannua I Col d Spring Harbor Lab. (1982) ) に従って実施するこ とが できる。
    [0045] なお、 宿主と して大腸菌を用いる場合は、 T 7フ ァー ジ由来のペプチ ド、 またはアン トラニル酸合成酵素 （以 下、 T r p Eと略す） 、 ；3—ガラク ト シダーゼ等のタ ン パク質を本発明のセリ ンプロテア一ゼの上流に切断可能 に連結してなるキメ ラ蛋白をコー ドする遺伝子を含む発 現ベクターを用いることにより、 発現効率を上げる こと ができる。 製造されたキメ ラ蛋白を酵素等で消化するこ とにより、 容易にセリ ンプロテア一ゼを単離できる。
    [0046] さ らに、 本発明は、 ヒ ト骨髄細胞由来のセ リ ンプロテ ァーゼの染色体遺伝子に含まれる転写制御領域をコ一 ド する D N A配列に関する。
    [0047] 本発明の転写制御領域とは、 プロモーター領域および ェンハンサ一を含むものであり、 それをコ一 ドする D N A配列は、 例えば 1 5図に示す配列またはこれと等価 な配列を含むものが挙げられるが、 これに限定されない。 ここに言う等価とは、 D N A塩基が部分的に他の D N A 塩基に置換されているもの、 部分的に削除されているも の、 他の D N A塩基が付加されているものなどであって、 しかも元の D N A配列と同等の機能を有する ものを言う。 第 1 5図の配列は、 第 1 6図に示される配列の 1〜 1 2 5 ◦番目の D N A配列に相当する。 第 1 6図は、 メ ダ ラシンの構造遺伝子およびその発現制御領域を含んだ染 色体遺伝子配列であって、 これはクローン化された約 6 キロ塩基の D N A断片のうち塩基配列が決定されたもの であり、 この中にはヒ トメダラシン遺伝子の完全長が含 まれており、 特徴的なプロモータ一構造である T A T A 配列、 C A A T配列も確認できる。 メダラシン c D N A の塩基配列との比較により、 メ ダラシン遺伝子は 4つの イ ン トロンにより分断された 5つのェキソ ンより成るこ とが明らかとなつた。
    [0048] 特徴的な構造と しては、 プロモータ一構造の上流に 5 3塩基対よりなる 4つのリ ピー ト配列、 また第 3イ ン ト 口ンには 4 2塩基対よりなる 1 0のダイ レク ト リ ピー ト 配列が観察される。 第 3イ ン ト ロ ンには複雑な 2次構造 をとり得る A T リ ツチな配列も存在している。
    [0049] プロモーター領域の近傍には、 転写調節因子の S Ρ 1 タ ンパクが結合する コ ンセ ンサス配列 （G G C G G G、 C C C G C C ) に似た配列も存在する。
    [0050] また、 メダラ シン遺伝子のタ ンパク合成開始領域の塩 基配列は、 コザッ クが効率的なタ ンパク合成開始に必要 と して提唱した塩基配列とよく 一致しているが、 このこ とはメ ダラ シンタ ンノ、。ク質がヒ ト末梢血 1 mlの中に約 1 0 U g と比較的多量に存在している理由の一つであると 推察される。
    [0051] また本発明者らは、 実施例に示したように細胞中のポ リ （ A ) + R N Aの量をノ一ザンブロ ッテイ ング法によ ' り調べるこ とによって、 メ ダラシ ンのポ リ （A) + R N Aがヒ ト急性前骨髄球性白血病細胞である M L 3細胞 (前述） 内に多量に発現されているが、 他の細胞、 例え ばヒ ト胎児肺組織由来正常 2倍体繊維芽細胞や、 ヒ トす い臓悪性上皮性腫瘍由来細胞株 M I A P a C a - 2細胞 には殆んど発現されていないことを見い出した。
    [0052] これらのことから本発明の転写制御領域は、 ヒ ト血球 系細胞、 特に赤芽球や顆粒球に特異的な遺伝子発現のた めの配列であると言える。
    [0053] 以下実施例を挙げて本発明をさ らに具体的に説明する。 実施例中、 成熟セリ ンプロテア一ゼとあるのは、 本発明 のセリ ンプロテア一ゼをセリ ンプロテアーゼ前駆体を混 同しないため用いた。 実 施 例 1
    [0054] セリ ンプロテアーゼ c D N Aの調製と塩基配列の決定
    [0055] ( A) D N Aプローブの合成 ：
    [0056] 青木らの方法 CJ.Biol.Cheni. 253, 2026-2032 (1978) 〕 に従って得た精製メ ダラ シン （セリ ンプロテア一ゼ） 2 25^ gを気相式自動べプチ ドシーケンサー 47 O A型
    [0057] (アプライ ド ♦ バイオシステムズ社製） で分析した。 得 られたフラク ショ ンを高速液体クロマ トグラフィ 一によ り分析し、 第 3図に示した N末端から 4 9ァ ミ ノ酸残基 の配列を決定した。 同図中で括弧が付されたア ミ ノ酸残 基は、 本分析法において若干の不確実性があるものであ o
    [0058] 上記 49ァ ミ ノ酸残基の中、 コ一 ドする D N A配列の 縮重度が少ない下記のァ ミ ノ酸配列部分
    [0059] 12T r p - P r o - P e -M e t -16V a 1
    [0060] を選び、 このア ミ ノ酸配列部分をコー ドする D N A塩基 配列に相捕な D N A'塩基配列の 5 ' 末端の 1個の塩基
    [0061] (これは Valをコー ドする第 3塩基である） を除く 14 塩基長の D N Aオリゴマー 8種 （プロ リ ンをコー ドする コ ドンは 4種、 フエ二ルァラニンをコー ドする コ ドンは 2種あることによる） を公知の方法によって化学合成し た。 これら 8種の D N Aオリ ゴマーの塩基配列は下記の とおりである。 得られた 8種の D N Aオリ ゴマーの等量 A C C A T A A A A G G C C A 5 3'
    [0062] A C C A T A A A C G G C C A
    [0063] 5' 3'
    [0064] A C C A T A A A G G G C C A 5' , %'
    [0065] A C C A T A A A T G G C C A
    [0066] 5' 3'
    [0067] A C C A T G A A A G G C C A
    [0068] 5' 3'
    [0069] A C C A T G A A C G G C C A
    [0070] A C C A T G A A G G G C C A
    [0071] 5' 3'
    [0072] A C C A T G A A T G G C C A 混合物の 5 ' 水酸基を T 4キナーゼと ァ 〔32P〕 A T P を用いてリ ン酸化標識し、 D N Aプローブを得た。
    [0073] ( B ) ポ リ （ A ) + R N Aの調製 ：
    [0074] 株化細胞 M L 3を 1 0 %牛胎児血清を含む R P M I 1 64 0培地で培養した。 培養は 5 %炭酸ガス濃度のもと に 3 7 Cで行なった。 細胞が約 1 X 1 0 ° cellsZmlの 密度に増殖したとき、 シク ロへキシ ミ ドを 3 0 g / ml の濃度になるように加え、 さ らに 5時間培養した。 こ う して得た細胞 （約 1. 4 X 1 0 9 個） に 6 Mグァニジン チオ シァネー ト、 2 %ザルコ シル、 5 0 πιΜト リ ス塩酸塩 (ρΗ7. 6 ) 1 0 πιΜΕ D T A , 1 % /3—メ ルカプ トエタ ノールの溶液 30 mlを加え、 得られた粘稠溶液を 18 G 注射針の中に 5回通した。
    [0075] この細胞ホモジネー トを 1 3容の 5. 7 M塩化セシ ゥム （ l O OmME D T Aを含む） 溶液の上に重層し、 3 50 0 0 rpffl で一晚 2 5。Cで遠心した。 遠心管の底に沈 澱した R N Aを少量の水に溶かし、 フエノール処理後ェ 夕ノール沈澱を行なう ことによって 640 ^ gの全 R N Aを得た。
    [0076] この全 R N Aを常法に従って、 オ リ ゴ d Tセル口一 スカラムク ロマ ト グラフィ ーに力、けて 8 6 μ gのポ リ ( A) + R N Aを選別収集した。
    [0077] ( C ) c D N Aの調製 ：
    [0078] 前記 （B) 項で得たポリ （A) + R NA 5 gを用い て c D N A合成キッ ト （Amershain製） を利用し、 そのプ ロ ト コールに準じて Gublerと Hoffmanの方法 （Gene, 25 , 263 (1983)) でニ本鎮 c D N A 640 ngを合成した。 次に c D N Aクローニングシステム一 λ gt 1 0 (Amersh am製 ）を用いて両端に E c o R I リ ンカ一を結合し、 E c o R Iで消化し、 ゲル萨過力ラムによって両端に E c o R I接着末端をもつ二本鎖 c D N A 434 ngを得た。 この二本鎖 c D N A 86 ngと 久 1:1 0ァ一ム 1 〃 とを T 4 D N Aリガ一ゼを用いて結合し、 これを； Iファージ • ノ ッケ—ジング ♦ ェクス トラク 卜に加えて組み換え、 ファージの混合物を得た CAmersham社製 c D N Aクロー ニングシステムの材料を使い、 その処方に従った〕 。 大 腸菌 NM 5 1 4を宿主と して 9 , 6 x 1 0 pfu (ブラ ーク ♦ フ ォ一 ミ ング ♦ ュニッ ト） の組み換えフ ァ ー ジ ( c D N Aライブラ リ 一） が得られた。
    [0079] (D) セ リ ンプロテア一ゼ c D N Aク ロー ンの単離 ： L B寒天培地の入った直径 14 5 mmのシャー レ当り大 腸菌 N M 5 14を宿主と して、 約 2 5 0 0 0個の前項で 得られた組み換えフ ァ ージをまき、 計 4枚のマスタ一プ レ一 トを作製した。 ニ ト ロセル口一スフイ ノレタ一にフ ァ ージを移したあと、 アルカ リ変成により フ ァージ D N A をフィ ルタ一上に固定した。 これらは Davisらの手法 (D.M. Glover編、 "DMA Cloning " ヽ vol Iヽ p49 〜78ヽ IRL Press 、 (1985)) に準じて行なった。
    [0080] (A) 項で作成した D N Aプロ一ブを用いて、 上記に より フ ァ一ジ D N Aを固定したフ ィ ノレ夕一をハイブリ ダ ィゼ一シ ヨ ン法でスク リ ーニングした。 ハイブリ ダィゼ —シ ヨ ンは 3 5。Cで行ない、 洗いも： 3 5 °Cで行なつた。 これらの操作は T.Maniatis らの方法 （ "Molecular C1 oni ng 、 A Laboratory MannuaT (1982) ) に準じてィ了な つた。 ハイブリ ダィゼーシヨ ンの結果、 オー トラ ジオグ ラフィ 一で陽性の 7個のクローンを得た。
    [0081] ( E ) セリ ンプロテアーゼ c D N Aの塩基配列の決定 ： 前項で得られた陽性ク ロー ンの中の一つである M E D 1 — 4 aのフ ァ ージ D N Aを抽出したあと、 E c o R I で切断して約 80 0塩基対の D N Aフラグメ ン トを得た。 この断片を - 一ゲンシング用ク ロ一ニングベク ター、 p U C 1 9 (宝酒造製） およびシーゲンシング用ファージ、 M 1 3 m P 1 9 (宝酒造製) 、 R F D N Aの E c o R I 部位に挿入した。 配列解析はデォキシ— 7—デァザグァ ニン ト リホスフエ一 トを用いたジデォキシ法で行なつた。 中央部については配列の確定した周辺部に対応したブラ ィマ一を順次合成してジデォキシ法により決定した。 こ のようにして第 4図に示す D N A塩基配列が決定された。
    [0082] 第 4図に示す D N A塩基配列のうち、 7番目の Cを含 んでその上流と 80 7番目の Gを含んでその下流は、 λ gt 1 0ベクタ一へのクロ一ニングに際して用いた E c ο R I リ ンカ一 G G A A T T C Cに由来する。 従って、 同 図の 8番目から 80 6番目までの D N A塩基配列がポリ
    [0083] ( A) + RN A由来の c D NAである。 この c D NA配 . 列について、 最長のオープンリ一ディ ングフレーム （タ ンパク質をコ一 ドする領域） を捜したところ、 同図の 8 - 番目から 7 1 8番目までの D N A塩基配列を翻訳したも のが最長であり、 7 1 9番目以下に終止コ ドン T G A力 続いていることがわかった。 8番目から 7 1 8番目まで の D N A塩基配列に対応する翻訳ァ ミ ノ酸配列は、 第 5 図に示すとおりである。 同図に示すア ミ ノ酸配列の 1番 目から 48番目は、 第 3図に示された精製メダラシンの ァ ミ ノ酸配列の 2番目から 4 9番目までと完全に一致し ている。 この結果から第 4図に示された D N A塩基配列 の中、 8番目から 7 1 8番目までは本発明のセリ ンプロ テア一ゼをコー ドする c D N Aを構成するものであると 結論でき、 この c D N A部分は第 2図に示されている。 この c D N Aは、 第 3図に示す精製メダラ シンの N末端 のア ミ ノ酸であるイ ソロイ シン （lie)をコー ドする部分 を欠いているが、 lie がメ ダラ シンの N末端であること は上述の精製メ ダラ シンのァ ミ ノ酸配列の解析結果から 明らかであるから、 本発明のセ リ ンプロテア—ゼをコ一 ドする全 c D N Aは、 第 2図の塩基配列の 5 末端側に H e をコー ドする A T T、 A T Cまたは A T Aが付加し たものであると結論できる。 この全 c D N Aに対応する ア ミ ノ酸配列、 すなわち本発明のセ リ ンプロテア一ゼの ァ ミ ノ酸配列が第 1図に示されている。
    [0084] 実 施 例 2
    [0085] セ リ ンプロテア一ゼ完全鎖長 c D N Aの調製と塩基配列 の決定
    [0086] 実施例 1で得たセリ ンプロテアーゼ部分 c D N Aをプ ローブと して、 実施例 1、 （ B ) 項と同様に調製した M L 3細胞のポ リ （A) + R N Aのうち 5 gを用いて実 施例 1、 ( C ) 項と同様な方法で新たに合成した約 1 0 0万個の； ί g t 1 0 c D N Aライブラ リ ーから実施例 1 で得られたク ロー ン M E D 1 — 4 aの 80 0塩基対より 長いセリ ンプロテアーゼ c D N Aを持つ 5つのクローン を単離した。 このうちク ローン M E D I Oおよび M E D 1 3のセ リ ンプロテアーゼの N末端をコ一 ドする領域の 塩基配列を実施例 1、 （E ) 項と同様な方法で決定した ところ、 M E D 1 — 4 aより M E D 1 3は 8 9塩基対、 t a
    [0087] ME D 1 0は 1 28塩基対上流まで含んでいた。 したが つて、 セ リ ンプロテアーゼ前駆体 c D N Aの配列は第 7 図の通りである。 これらの D N A配列から推定するとセ リ ンプロテア一ゼ前駆体は 26 7ア ミ ノ酸から成り、 成 熟セリ ンプロテア一ゼの N末端にあるイ ソロイ シンの上 流にさ らに 29個めア ミ ノ酸が結合している （第 6図） 。 この 2 9ア ミ ノ酸から成る リ一ダーぺプチ ドのうち N末 端側の 2 7ア ミ ノ酸は 1 7個の疎水性ァ ミ ノ酸 （口イ シ ン 9ケ、 ァラニン 5ケ、 フエ二ルァラニン 1 ケ、 バリ ン 1 ケ及びプロ リ ン 1ケ） から成ると共に、 そ の C末端側にァラニン一ロイ シンーァラニンという最も シグナルぺプチダーゼで認識され易い配列を持つことか -らシグナルペプチ ドと考えられる。 また、 このシグナル ぺプチ ドの下流に存在するセリ ンーグルタ ミ ン酸という 2ア ミ ノ酸からなるペプチ ドは、 活性化べプチ ドと推定 される。
    [0088] 実 施 例 3
    [0089] セ リ ンプロテアーゼ大腸菌癸現べク 夕一 p E TME Dの 作製と T 7—セリ ンプロテア一ゼキメ ラ蛋白の発現
    [0090] ( A ) 成熟セリ ンプロテア一ゼ c D N Aベクター p U C 1 9 Y M E Dの作製 ：
    [0091] 実施例 1で得た第 4図に示す D N Aの E c o R I断片 を、 先ずク口一ニングべク夕一 p U C 1 9の E c o R I 部位に揷入し、 第 4図の D N Aの下流部位が p U C 1 9 の B a m H Γ部位に近い揷入方向のクローン p U C 1 9 M E D 1 — 4 aを選び、 プラス ミ ド D N Aを得た。
    [0092] このべクタ一 P U C 1 9 M E D 1 — 4 aを H i n d IE で完全消化後 N a e Iで部分消化し、 約 80 0塩基対か ら成るセ リ ンプロテアーゼ部分 c D N Aを分離した。 こ の D N A断片と成熟セリ ンプロテア一ゼの N末端をコー ドする合成オリ ゴマ一を T 4 D N Aリ ガーゼを用いて p U C 1 9の E c o R I サイ ト と H i n d mサイ トの間に 揷入することにより、 成熟セリ ンプロテア一ゼ c D N A を持つベク タ一 P U C 1 9 Y M E Dを作製した （第 8 図） 。
    [0093] ( B ) p E T M E Dの作製 ：
    [0094] F. Vi 1 lai Studier博士 (Biology Departmen , Brookh aven National Laboratory. Upton - New York)よ ^)分与 された p E T— 3 bを T 7プロモー夕の下流にある B a m H I で完全消化して力〕らマングビーンヌ ク レア一ゼ （ Mung bean nuclease) 処理により平滑末端化した。 次に ( A ) 項の p U C 1 9 YM E Dを E c o R Vと H i n c Πで完全消化し、 成熟セリ ンプロテア一ゼ c D N Aから 成る約 0. 8 K bの D N A断片を分離した。 これら 2つ の D N A断片を T 4 D N A リガーゼを用いて結合するこ とによりセリ ンプロテアーゼ大腸菌発現ベクター p E T M E Dを作製した （第 9図） 。 このべクタ一からは T 7 フ ァージ由来の 1 1ア ミ ノ酸（Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly -Gly-Gln-Gln-Met-Gly) から成るペプチ ドと 2 38ア ミ ノ酸から成る成熟セリ ンプロテア一ゼがアルギニンをは ざんで結合した 25ひア ミ ノ酸のキメ ラ蛋白が作られる。 成熟セ リ ンプロテア一ゼは、 このキメ ラ蛋白を ト リ プシ ンで部分消化することにより単離できる。
    [0095] ( C ) p E TM E Dによる T 7—セリ ンプロテアーゼキ メ ラ蛋白の発現 ： ，
    [0096] まず、 （B) 項で作製した £丁1^£ 0を大腸菌11？^ S 1 74 (J.L, Campbellら、 Proc. Natl . Acad..Sci . , U.S. A.75. 2276-2280 (1978)) に導入した。 この組換え 体をア ンピシリ ンを 1 0 0 g mlの、 またマル ト一ス を 0- 4 % (v / v) の濃度で含む 5 mlの L B培地 （T.Ma niatisら， "Molecular Cloning " p440. (1982)) で 3 7。C、 一晚培養後、 そのうち 0. 1 mlをアンピシリ ン及 びマルトースをそれぞれ 1 0 0 gノ. ml及び 0. 4 % (w /v) の濃度で含む N Z C YM培地 （T.Maniantis ら、
    [0097] "Molecular Cloning " 、 p440 (1982) ) に移し、 波長 6 0 0 πιπでの吸光度が 0. 3となるまで 3 7 °Cにて培養 後、 大腸菌数の 5倍から 1 0倍のフ ァージ C E 6 (F.W. Studier ら、 J.Mol.Biol.. 189, 113-130 (1986)) を感 染させた後、 3時間 3 7 Cで培養した。 こ う して得られ た菌体の全蛋白質を S D Sポ リアク リルァ ミ ドゲル電気 泳動により解析したところ、 コ ン ト ロールの p E T— 3 b (前述） を導入 た組換え体には見られない分子量約 2 9 , 0 00の蛋白が観察された。 この蛋白が T 7セ リ ンプロテア一ゼキメ ラ蛋白であることは、 抗セリ ンプロ テア一ゼ抗体を用いたウェスタ ンブロ ッティ ングによ り ΐ宦 した。
    [0098] 実 施 例 4
    [0099] T—r p E—セ リ ンプロテア一ゼ発現べクタ一 p A T H 2 M E Dの作製と T r p Eーセリ ンプロテア一ゼキメ ラ蛋 白の発現
    [0100] ( A) T r p E—セ リ ンプロテアーゼ発現ベクター p A
    [0101] T H 2 M E Dの作製 ：
    [0102] 実施例 1の p U C 1 9 M E D l — 4 aを H i n d ΠΙで 完全消化後 N a e I で部分消化しセ リ ンプロテア一ゼ部 分遺伝子を含む約 80 0塩基対の D N A断片を分離した。 この断片と、 セ リ ンプロテア一ゼの N末端側をコ一 ドす る合成オリ ゴマーを T 4 D N A リガ一ゼを用いて、 T r p Eキメ ラ蛋白発現用ベク ター p A T H 2 (C.L.Dieckin an and A.Tzagoloff , J . Biol . Chein . 260. 1513〜 1520 ( 1985) ) の S a 1 Iサイ ト と H i n d lEサイ トの間に挿 入し、 T r p E -セリ ンプロテアーゼのキメ ラ蛋白を発 現させるベクター p A T H 2 M E Dを作製した （第 1 0 図） 。
    [0103] このべクタ一からは、 T r p E由来の 3 3 1ア ミ ノ酸 から成るペプチ ドと 2 38ア ミ ノ酸から成る成熟セ リ ン プロテア一ゼがリ ジンをはさんで結合した 5 7 0ァ ミ ノ 酸から成るキメ ラ蛋白が作られる。 成熟セ リ ンプロテア ーゼはこのキメ ラ蛋白をエン ドプロテアーゼ 1 y s Cで 部分消化することによ り単離できる。
    [0104] ( B) p A T H 2 M E Dによる T r p E—セ リ ンプロテ ァーゼキメ ラ蛋白の発現 ：
    [0105] p A T H 2 M E Dで形質転換した大腸菌 H B 1 ◦ 1を ァンピシリ ンを 1 0 0 ^ g Zmlの濃度で含む 5 mlの L B 培地 (T.Marliatis らヽ "Molecular Cloning " p440 ( 1982) ) にて 3 0。C 7時間培養後、 そのうちの 4mlを硫 酸マグネシウム、 塩酸チア ミ ン、 グルコース及びアンピ シ リ ンをそれぞれ l mM、 1 H g /ml^ l % (w/v) 及び 1 0 ◦ g Zmlの濃度で含む 4 0 mlの M 9培地 （T.Mani atisら、 "Molecular Cloning " ρ6δ (1982)) に移し、 2 5。Cで一晚培養した後、 4 0 % (v/v) グルコースを 0. 8ml、 14 % (v/v) 水酸化ア ンモニゥムを 0. 1 6 ml、 及び 1 ◦ nigZ mlイ ン ドールアク リル酸を 4 ◦ ^ 1加えて さらに 8時間培養した。
    [0106] 全菌体の蛋白質を S D Sポリァク リルア ミ ドゲル電気 泳動により確認したところコン ト口一ルの p A T H 2を 導入した H B 1 0 1には見られない分子量約 6 1 , 0 0 0の T r p E—セ リ ンプロテア一ゼのキメ ラ蛋白が確認 された。 この蛋白がセリ ンプロテア一ゼのキメ ラ蛋白で あることは、 抗セリ ンプロテア一ゼ抗体を用いたウェス タンブロッテイ ングにより確認した。
    [0107] 実施例 5
    [0108] セ リ ンプロテア一ゼ酵母べ タ_— p A TME Dの作製と セ リ ンプロテア一ゼの発現
    [0109] ( A ) セリ ンプロテア一ゼ前駆体 c D N Aベクタ一 p U C 1 9 PME Dの作製 ： 実施例 3の P U C 1 9 M E D 1 3を H i n d mで完全 消化後 E c 0 52 Iで部分消化する こ とによ り約 9 5 0 塩基対の D N A'断片を分離した。 この断片と、 セリ ンブ 口テアーゼ前駆体の N末端をコ一 ドする合成オ リ ゴマー を p U C 1 9の E c o R Iサイ ト と H i n d HIサイ トの 間に、 T 4 D N A リガーゼを用いて揷入することにより セリ ンプロテア一ゼ前駆体 c D N Aを持つベクター p U C 1 9 P M E Dを作製した （第 1 1図） 。
    [0110] ( B ) p A T M E Dの作製 ：
    [0111] まず、 広島大学の東江博士より供与された酵母の P H 0 5 (抑制性酸性ホスファ タ一ゼ） プロモータを持つベ クタ一 P A T 4 0 5を X h o Iで完全消化後、 T 4 D N Aポ リ メ ラーゼ処理により平滑末端化してから大腸菌ァ ルカ リ フ ォスファタ一ゼ処理により末端のリ ンを除いた。
    [0112] 次.に ( A) 項の p U C 1 9 P M E Dを E c o R Iで完 全消化後、 T 4' D N Aポ リ メ ラ一ゼ処理により平滑末端 化してからセ リ ンプロテア一ゼ前駆体 c D N Aを含む約 9 5 0塩基対の D N A断片を分離した。 これら 2つの D N A断片を T 4 D N A リガ一ゼを用いて結合することに よ りセ リ ンプロテア一ゼ酵母発現ベクター p A TM E D を作製した （第 1 2図） 。
    [0113] ( C ) p A丁 M E Dによるセ リ ンプロテア一ゼの発現 ： p A T M E Dを導入した酵母 D C 5 (広島大学東江博 士より供与された） をヒスチジンとグルコースをそれぞ れ 0. 1 mg/ml及び 2 % (w/v) の濃度で,含む 5 mlの Yeas t Nitrogen Base 培地 （Difco 社製） にて一晚 3 0 で 培養後、 その 2. 5 mlを 5 0 mlの同一培地に移し、 さら に 3 0でで一晚培養した。 集菌後 50 mlの水で一度洗つ てから、 5 Omlの無リ ン酸培地 （Yeast Minimal Medium (R.L.Rodriguez and R.C. Trait "Recombinant DNA Tech niques" pl5i (1983) ) の K H 2 P 04 の代わりに K C 1 を甩ぃリ ン酸を除いた培地） に懸濁し、 3 0でで 2晚 培養した。 培養上清 1 mlを凍結乾燥により濃縮してから S D Sポリアク リルアミ ドゲル電気泳動により解析した ところ、 コ ン トロールの p A T 4 0 5を導入した D C 5 の培養上清には見られない分子量約 32, 0 0 0の蛋白 が検出された。 この蛋白がセリ ンプロテアーゼであるこ とは抗セリ ンプロテア一ゼ抗体を用いたウエスタ ンプロ ッティ ングにより確認した。
    [0114] 実 施 例 ら
    [0115] セリ ンプロテア一ゼの酵母 _発現べクター T3 MF a M E D の作製と酵母での発現
    [0116] ( A ) セリ ンプロテア一ゼ酵母発現べクタ一 p M F M E Dの作製 ：
    [0117] 実施例 4 ( A ) 項の p U C 1 9 YME Dを E c o R I と H i n c Πで完全消化し、 成熟セリ ンプロテアーゼ c D N Αから成る約 80 0塩基対の D N A断片を分離した。 次に、 酵母の交配フヱ σモンである a—ファクターのプ 口モータと リーダ一配列を持つベクタ一 p M F α 8 (A. Miyajimaら、 Gene, 37. 155 (1985) ) を S t u Iで完全 消化後、 大腸菌アルカ リ フ ォ スフ ァターゼ処理により脱 リ ン酸化した。 これら 2つの D N A断片を T 4 D N A リ ガーゼを用いて結合することによりセリ ンプロテア一ゼ 酵母発現用べクタ一 P S R M E Dを作製した （第 1 3 図） 。
    [0118] ( B ) p S R " M E Dによる酵母 2 0 B 1 2の形質転換 ： ( A ) 項の p S R M E D 1 0 〃 gを約 l x l O 7 個 の酵母 2 0 B 1 2 (広島大学東江博士より供与された） に、 アルカ リ金属処理法 （A.Kimuraら、 J . Bacteriol . , 153, 163 (1983) ) によ り導入した。 得られた形質転換 体をグルコースを 2 % (w/v) の濃度で含む 5 mlの Yeast Nitrogen Base 培地 （ Di f co 社製） にて、 3 0 °C—晩培 養後、 その 1 miを 1 O miの同じ培地に移し、 さ らに 2 4 時間培養した。 培養上清 1 ∞1を凍結乾燥によ り濃縮して から、 抗セリ ンプロテア一ゼ抗体を用いたウェスタ ンブ ロ ッティ ングにより解析したところ、 コ ン ト ロールの p M F a 8を導入した 2 0 B 1 2の培養上清には見られな い分子量約 3 2 , 0 0 0の蛋白が検出された。
    [0119] 実 施 例 7
    [0120] セ リ ンプロテァーゼの動物細胞発現ベクター p S R a M E Dの作製と動物細胞での発現
    [0121] ( A ) セ リ ンプロテア一ゼ動物細胞発現ベクター p S R Μ Ε Όの作製 ：
    [0122] 実施例 6 ( A ) 項の p U C 1 9 P M E Dを E c o R I で完全消化し、 セ リ ンプロテア一ゼ前駆体 c D N Aを含 む約 9 5 ◦塩基対の D N A断片を分離した。 これを、 p c D L S R a 2 9 6 (DNAX社、 武部博士より供与された） を E c o R Iで完全消化後、 大腸菌アル力 リ フ ォスフ ァ ターゼ処理により脱リ ン酸化したベクターに、 T 4 D N A リガ一ゼを用いて結合させることによりセリ ンプロテ ァーゼ動物細胞発現べクター p S R a M E Dを作製した (第 14図） 。
    [0123] (B) p S R M E Dによる C o s — 1細胞の形質転換 ： ( A) 項の p S R ME D l O /z gを約 2 x 1 0 6 個 のサル腎臓由来の C o s — 1細胞 （Y.Gluzman, Cell , 3, 175 (1981) ) にリ ン酸カルシウム法 （F.し. Grahamら、 Virology, 54, 536 (1873)) により導入した。 5日後に 細胞を集め全細胞の蛋白質を抗セリ ンプロテア一ゼ抗体 を用いたゥエスタ ンプロッティ ングにより解析したとこ ろ、 べクタ一を導入していない C o s — 1細胞には見ら れない分子量約 : 3 0 , 0 0 0の蛋白が検出された。 また、 細胞を凍結融解により破壊後 1 2 0 0 0 g、 3 0分間の 遠心により得られた可溶性画分について、 エラスタ一ゼ の基質である -nitrophenyl N-tert-buty loxycarbon l- L-alaninate を基質とした方法で（し sser ら、 Bioche e.Biophys.Acta. , 268, 257 (1972)) 、 本酵素の活性を 測定したところ ン トロールに比べ約 1 x 1 0 s 細胞あ たり 347. 511111の吸光を 0. 1上昇させる活性が検出 された。
    [0124] 実 施 河 8 染色体 D N Aのサザンハイブリ ダィゼ一シヨ ン
    [0125] ヒ トセ リ ンプロテア一ゼ遺伝子のク ロ一ニングに先立 ち、 まず、 染色体 D N Aのサザンハイブリ ダィゼ一シ ョ ンを行なった。 ヒ ト扁挑由来の染色体 D N A (調製法は、 P.Chanibon ら Eur . J . Biochein , 36. 32-38 (1973 年） に 記載の方法に従った。 ） の各 1 0 gを制限酵素 E c 0 R I、 B a mH I、 P s t Iで切断、 ァガロースゲル電 気泳動 （ 1 %ァガロース） し、 サザンブロ ッティ ング後、 セリ ンプロテアーゼ c D N Aをプローブと してサザンハ イブリ ダィゼ一シ ヨ ンを行なった。 その結果、 E c o R I切断では約 6 kbの断片のみがセ リ ンプロテア一ゼ c D N Aプローブとハイプリ ッ ドを形成し、 ヒ トセリ ンプロ テアーゼ遺伝子は染色体に 1種類のみ存在し、 E c o R I の 6 kbの断片にのみ含まれることが明らかとなった。 こ こで用いたセ リ ンプロテア一ゼ c D N Aプローブは、 Okano K.ら J. Biochem, 102, 13〜16 (1987) に記載さ れた c D N A配列 （ E c o R I挿入断片、 約 80 0 bp) をニッ ク ト ラ ンス レー シ ョ ン法によって" Pで標識した ものである。
    [0126] 実 施 例 9
    [0127] ヒ トセ リ ンプロテア一ゼ遺伝子 _のク ローニング
    [0128] ヒ ト染色体 D N A約 1 0 0 ^ gを E c o R Iで切断し、 ァガ口—スゲル電気泳動後、 約 6 kb近傍の D N Aを回収 した。 ス フ ァージ由来のベク タ ー ； l g t WE S * ;i y3の E c o R I アーム D N A ( B R L社のより購入） をべク ターと して、 回収した D N Aと結合 （リガーゼ反応） さ せ、 in vitroノヽ0ッケージンク in vitroノヽ0ッケ—シ ンク キッ トは宝酒造㈱より購入） により遺伝子ライブラ リ一 を作製した。 0. 5 gの回収 D N Aと 0. l gべク ター D NAから 5 x l 04 pfu の遺伝子ライブラ リ一力 作製できた。 この遺伝子ライブラリ一とセリ ンプロテア —ゼ c D NAをニッ ク ト ラ ンス レー シ ョ ン （ニッ ク トラ ンス レ一シヨ ンキッ トは宝酒造線より購入） した D NA をプローブと して、 通常のプラークハイブリダィゼ一シ ョ ン法 〔T.Maniatisら、 "Molecul ar Cloning ： A Labo ratory Manual " (以下書籍 Aと略す） P.312〜328, C ' old Spring Harbor Laboratory (1982年） 〕 でスク リー -ニングを行なった。 その結果、 3個のポジティ ブクロー ンが得られた。 そのうちの一つが； M E D - 2である。 実施例 1 0
    [0129] λ M E D - 2の塩基配列の決定
    [0130] A ME D— 2の E c o R I揷入断片をシーク ェンス用 ベクタ一 p U C 18 D NA、 または p U C 1 9 D NA
    [0131] (宝酒造㈱より購入） にサブクローニングし、 キロデリ — シ ヨ ンキッ ト （宝酒造㈱より購入） を用い適当な欠失 変異株を得、 それぞれについて 7— D E A Z Aシークェ ンスキッ ト （宝酒造㈱） を用いたジデォキシシークェン ス法により塩基配列の決定を行なった。 その結果を第 1 6図に示す。 すなわち、 クローン λ M E D— 2の揷入断 片のうち、 塩基配列を決定した 52 9 2塩基を第 1 6図 に示した。 C A A Tボッ クス、 T A T Aボッ クス、 poly A付加シグナルを小さな四角で囲み、 セリ ンプロテア一 ゼポ リ （A) + R N Aのうち、 タンパク質をコー ドする 領域を四角で囲った。 プロモータ一上流部分と第 3イ ン ト 口ン内に存在する反復配列を矢印のついた下線で示し た。 ただしポリ （A) + R N Aの 5 / 末端位置は数塩基 程度の誤差のある可能性がある。
    [0132] 実施例 1 1
    [0133] M L 3細胞、 ヒ ト胎児肺由来正常 2倍体繊維芽細胞お よび M I A P a C a - 2細胞の各々を、 1 0 %牛胎児血 清を含んだ R P M I 1 64 0培地 （M L 3 ) 、 1 0 %牛 胎児血清を含んだイーグル M E M培地 （ヒ ト胎児.肺由来 正常 2倍体繊維芽細胞） 、 または 1 0 %牛胎児血清と 2. 5 %の馬血清を含んだダルべッ コ M E M培地 （M I A P a C a — 2細胞） で、 それぞれ 5 %炭酸ガスのも とで 3 2 °Cで培養した。 2ないし 5 X 1 0 8 個の細胞に 6 Mグ ァニジ ンチオ シァネー ト、 2 %ザルコ シル、 5 0 m M ト リ ス塩酸塩 （PH7. 6 ) 、 1 0 mM E D T A、 1 % β 一メルカプ トエタノールを含んだ溶液 1 6 mlを加え、 得 られた粘稠溶液を 1 9 G注射針の中に 5回通した。 この 細胞ホモジネー トを 1 8 mlの 5. 7 M塩化セシウム （ 1 0 0 mM E D T Aを含む） 溶液の上に重層し、 3 5 0 0 0 rpni で一晚 2 5 で遠心した。 遠心管の底に沈澱し た R N Aをノくッ フ ァー液に溶かしフ ノール処理後、 ェ タノ一ル沈澱を行なう ことによって全 R N Aを得た。 こ れらの操作は、 書籍 Aの 1 9 6頁に記載された方法に準 じて行なつた。 得られた全 R N Aは 20 0〜 6 0 0 ^ g" であった。 これらの全 RN Aを同書 1 9 2〜 1 98頁の 方法によってオリ ゴ d Tカラムにかけポリ （ A ) ÷ R N Aを得た。 これらのポリ （A) + R N Aを各々 l O i g をホルムアルデヒ ド♦ ァガロースゲル電気泳動にかけ、 ニ トロセルロースのフィ ルタ一に移した。 これらの操作 は同書 2 0 2〜 2 0 3頁の方法によつた。
    [0134] こう して得られた二 トロセル口一スフィ ルターをノザ ンハイブリ ダィゼ一シヨ ンで分析した。 方法は同書 38 7〜 389頁のサザンハイブリダィゼ一ショ ンに準じて 行なった。 プローブと して、 Okano K,ら J. Biochem. 1 02, 13〜； L6 (1987) に記載されたセリ ンプロテア一ゼ
    [0135] (メダラ シン） の c D N Aをニック ト ラ ンス レーシ ョ ン の方法 （書籍 Aの 1 ◦ 9〜 1 1 2頁） で、 〔a 32P〕 d C T Pでラベルした比活性約 1 X 1 0 8 cpinZ gのも のを用いた。 プローブの濃度は、 2 x 1 0 s cpm/mlで ハイブリ ダィゼーシヨ ンを 5 0 %ホルムア ミ ド 4 2。Cの 条件で行なった。 増感スク リ 一ンの存在下、 一 7 0てで コダッ ク社 X A R— 5フ ィ ルムを一晚感光させたところ、 ML 3細胞の: R N Aを電気泳動したレー ンには約 1 0 0 0塩基の長さのところに明瞭なバン ドが観察された。 し かしながら、 他の細胞から得た： N Aを泳動したレーン には、 認め得るバン： ドは見られなかった。
    [0136] 産業上の利用可能性 本発明のセ リ ンプロテアーゼは、 炎症の発現に関与す るため炎症阻害剤の開発に重要であり、 さ らに リ ンパ球、 単球、 N K細胞、 及び顆粒球の機能を変化させる作用が ある。 従って医療分野において非常に有用である。
    [0137] また、 本発明のセリ ンプロテアーゼは有用な医薬品と なり得る。 例えば、 本発明のセリ ンプロテアーゼは血栓 溶解作用があるため、 汎発性血管内凝固症候群 （DIC ： disseminated intravascular coagulation) の血栓溶解 剤と して使用可能である。 従来 D I Cの治療に、 植物由 来のプロテアーゼであるパパイ ンを使用する ことがある 力 作用が強すぎることと、 免疫によるアレルギー症状 の誘起等のため危険な副作用が心配されている。 この点、 本発明のセリ ンプロテア一ゼはヒ ト由来の酵素であるた め安全に使用できるという長所がある。 さ らに他の医薬 の応用例と して、 外傷治療段階において、 古い皮膚組 織あるいは肉芽状に盛り上がつた組織の除去修正を目的 と した外用薬と して使用可能である。 この場合も、 本発 明のセリ ンプロテア一ゼはヒ ト由来であるため安全であ 0
    [0138] さ らに、 本発明の細胞特異的な遺伝子発現に必要な転 写制御領域の D Ν Α配列は、 白血球も しく は赤血球細胞、 なかんずく 、 これらに由来する培養細胞において外来遺 伝子の発現を特異的に行なわせるために有用である。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1 . 第 1図に示すア ミ ノ酸配列を有するポリペプチ ドが 呈する生物活性を持つセリ ンプロテアーゼ。
    . 第 1図に示すア ミ ノ酸配列を有するポリベプチ ドが 呈する生物活性を持つセリ ンプロテア一ゼをコ一 ドす るセ リ ンプロテア一ゼ遺伝子。
    3 . 第 2図に示す D N A塩基配列を含む請求の範囲第 2 項記載のセリ ンプロテアーゼ遺伝子。
    . 第 1図に示すァ ミ ノ酸配列を有するポ リぺプチ ドが 呈する生物活性を持つセリ ンプロテア—ゼの N—末端 に、 開裂可能なぺプチ ド又はシグナルべプチ ドが結合 してなるセリ ンプロテア一ゼ前駆体。
    5 . 第 6図に示すア ミ ノ酸配列を有する請求の範囲第 4 項記載のセリ ンプロテアーゼ前駆体。
    6 . 第 1図に示すア ミ ノ酸配列を有するポリペプチ ドが 呈する生物活性を持つセリ ンプロテア一ゼの N—末端 に、 開裂可能なペプチ ド又はシグナルペプチ ドが結合 してなるセリ ンプロテア一ゼ前駆体をコー ドするセリ ンプロテアーゼ前駆体遺伝子。
    7 . 第 7図に示す D N A塩基配列を含む請求の範囲第 6 項記載のセリ ンプロテアーゼ前駆体遺伝子。
    8 . ヒ ト骨髄由来のセ リ ンプロテアーゼの染色体遺伝子 に含まれる転写制御領域をコ一 ドする D N A配列。
    9 . 第 1 5図に示す配列またはこれと等価な配列を含む 請求の範囲第 8項記載の転写制御領域をコー ドする D 1
    31
    N A配列。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Krusius et al.1986|Primary structure of an extracellular matrix proteoglycan core protein deduced from cloned cDNA
    Fisher et al.1986|cDNA sequencing of nuclear lamins A and C reveals primary and secondary structural homology to intermediate filament proteins
    Ishidoh et al.1987|Molecular cloning and sequencing of cDNA for rat cathepsin L
    Guazzi et al.1990|Thyroid nuclear factor 1 | contains a homeodomain and displays a novel DNA binding specificity.
    Neeper et al.1990|Characterization of recombinant tick anticoagulant peptide. A highly selective inhibitor of blood coagulation factor Xa.
    Demuth et al.1986|Cloning and structural characterization of a human non‐erythroid band 3‐like protein.
    Tan et al.1993|Sequencing and cloning of human prolylcarboxypeptidase |. Similarity to both serine carboxypeptidase and prolylendopeptidase families.
    Maeda et al.1985|Differential RNA splicing and post-translational cleavages in the human salivary proline-rich protein gene system.
    DK172625B1|1999-03-15|Ekspressionsvektor eller et par af ekspressionsvektorer omfattende heterolog DNA, som koder for alfa- og beta-underenhedern
    RU2194758C2|2002-12-20|СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО ПОЛИПЕПТИДА В ДРОЖЖАХ Saccharomyces cerevisiae
    Neumaier et al.1988|Characterization of a cDNA clone for the nonspecific cross-reacting antigen | and a comparison of NCA and carcinoembryonic antigen.
    EP0138111B1|1991-11-21|Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms
    KR100249572B1|2000-03-15|면역글로불린 부분을 갖는 융합 단백질 및 이의 제조방법
    Kojima et al.1989|Cloning and sequence analysis of cDNA encoding a precursor for rat brain natriuretic peptide
    AU764441B2|2003-08-21|cDNAs encoding secreted proteins
    Forde et al.1985|Short tandem repeats shared by B‐and C‐hordein cDNAs suggest a common evolutionary origin for two groups of cereal storage protein genes
    Kristensen et al.1991|Two alternatively spliced mouse urokinase receptor mRNAs with different histological localization in the gastrointestinal tract.
    EP0251505B1|1995-03-08|Recombinant purified protease nexin
    ES2298785T3|2008-05-16|Proteinas de fusion.
    KR100858009B1|2008-09-11|세균 배양물의 상층액으로 목적 단백질의 분비를 위한 융합 단백질
    DK175217B1|2004-07-12|Hirudinanalog, vektorer til ekspression af hirudinanalog, transformerede celler og fremgangsmåde til fremstilling af hirudinanalog
    JP2634193B2|1997-07-23|ヒトプロアポリポタンパク質ａ−１の発現
    US4897348A|1990-01-30|Recombinant materials and methods for producing human connective tissue-activating peptide-III and analogs thereof
    RU1804480C|1993-03-23|Способ экспрессии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в ЕSснеRIснIа coLI
    AU729880B2|2001-02-15|Recombinant vascular endothelial cell growth factor D |
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE3854517D1|1995-11-02|
    JP2623807B2|1997-06-25|
    AT128484T|1995-10-15|
    DE3854517T2|1996-02-22|
    EP0307478B1|1995-09-27|
    EP0307478A1|1989-03-22|
    EP0307478A4|1989-12-28|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1988-09-07| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    1988-09-07| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1988-11-04| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1988902211 Country of ref document: EP |
    1989-03-22| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1988902211 Country of ref document: EP |
    1995-09-27| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1988902211 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP62/50676||1987-03-05||
    JP5067687||1987-03-05||
    JP22554087||1987-09-09||
    JP62/225540||1987-09-09||DE19883854517| DE3854517D1|1987-03-05|1988-02-26|Serin-protease und serin-protease-gen.|
    JP63502059A| JP2623807B2|1987-03-05|1988-02-26|セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ遺伝子|
    EP19880902211| EP0307478B1|1987-03-05|1988-02-26|Serine protease and serine protease gene|
    DE19883854517| DE3854517T2|1987-03-05|1988-02-26|Serin-protease und serin-protease-gen.|
    [返回顶部]